沉降系數(shù)測定是分析離心機(jī)最主要的用途。通常只需要幾十毫克甚至幾十微克樣品，配制成1~2毫升溶液，裝入分析池，以幾小時的分析離心，就可以獲得一系列的樣品離心沉降圖。根據(jù)沉降圖可以作樣品所含組分的定性分析，亦可以測定各組分的沉降系數(shù)和估計(jì)分子大小，作樣品純度檢定和不均一性測定，以組分的相對含量測定。
1.原理
沉降系數(shù)的測定原理就是在恒定的離心力場下測定樣品顆粒的沉降速度。因?yàn)闃悠奉w粒很小，不能直接看到它們的沉降運(yùn)動，所以把離心時樣品顆粒的界面移動速度看作是樣品顆粒的平均沉降速度。通常使用Schlieren和吸收光學(xué)系統(tǒng)來記錄界面沉降圖。在沉降圖中樣品界面一般表現(xiàn)為一個對稱的峰，峰的最高點(diǎn)代表界面位置。通常沉降系數(shù)測量精度為?%,但是如果面界圖型表現(xiàn)為不對稱峰型，或希 望沉降系數(shù)測量精度達(dá)到?%或更小的情況時，按峰的最高點(diǎn)作為界面位置就不夠了這時應(yīng)該使用二階距法計(jì)算界面位置。
2.沉降系數(shù)測定實(shí)例
?、艠悠罚号Ｑ灏椎鞍?BR> ?、茦悠啡芤号c離心：按0.6%濃度將牛血清白蛋白溶于0.14M NaCl、0.01M磷酸緩沖液中，pH7.0。用12mm厚雙槽分析池，一邊加入溶液一邊加入溶劑，約各0.3ml。分析池與平衡池平衡重量，使平衡池比分析池輕0.5g以內(nèi)，然后分別裝入分析轉(zhuǎn)頭。分析轉(zhuǎn)頭裝于分析離心為什么，關(guān)轉(zhuǎn)動腔，抽真空。開 Schlieren光光源，選擇工作速度一60000轉(zhuǎn)/分，離心室溫。轉(zhuǎn)動腔達(dá)到真空后離以機(jī)開始運(yùn)轉(zhuǎn)加速，此時在觀察窗口可以看到離心圖型。達(dá)到工作速度后即為恒速離心。待看到樣品峰的尖端后即可以6分 鐘間隔照相，共照6張。照完相即可關(guān)機(jī)，取出樣品液，清理轉(zhuǎn)頭和分析池。照相用強(qiáng)反差顯影沖洗后即得Schlieren光路沉降圖形照片。
?、浅两祱D象測量：Schlieren沉降圖可以用比長儀，讀數(shù)顯微鏡，或投影儀測量。要求測量的橫向量程為6cm，測量精度應(yīng)優(yōu)于10μm。通常讀數(shù)顯微鏡已能滿足要求。投影儀可以使圖象放大于屏幕上，讀測比較容易，眼睛不易疲勞。測量時把沉降圖象的底片放于測量儀器上，使液面的垂直線與測量儀中的垂直線重合，然后用十字標(biāo)線依次測量內(nèi)參孔，液面，界面峰尖，和外參考孔的位置，每個圖象至少讀測三次，取平均值。依次把每個圖象依同樣方法測量，把數(shù)據(jù)列成表。
照相號 x1(mm) x2(mm) x3(mm) x4(mm) (x3-x1)/a log[5.65+(x3-x1)/a]
1 45.426 37.626 33.807 13.810 0.6125 0.7967
2 45.640 37.830 33.351 13.420 0.6485 0.7992
3 45.890 38.070 32.895 13.663 0.6854 0.8017
4 45.733 37.921 32.163 13.523 0.7161 0.8039
5 45.802 38.000 31.580 13.593 0.7507 0.8062
6 46.009 38.211 31.172 13.800 0.7830 0.8084
(4)沉降系數(shù)S的計(jì)算：沉降圖測量完，先檢查每一張圖和第六張圖的x2-x1值，二張圖的x2-x1值的差應(yīng)該小于界面峰位置的測量誤差。實(shí)測x2-x1的差值為0.002，說明液面在離心30分鐘內(nèi)變動為 0.002mm。界面峰在30分鐘內(nèi)移動距離是第六號圖的x1-x3減第一號圖的x1-x3，是3.208mm,其峰位測量意味著允許為0.03?？蓛?nèi)陸液面變動0.002mm遠(yuǎn)小于峰位測量誤差0.03mm，說明離心時沒有發(fā)生漏液。
按a=(x4-x1)/1.7求算光路對分析池的放大倍數(shù)，然后按(x3-x1)/a求算界面峰離開內(nèi)參考孔的實(shí)際距離，再按x=5.65+(x3-x1)/a求算界面峰離開旋轉(zhuǎn)中心的實(shí)際距離，再由對數(shù)表求算logx植，計(jì)算數(shù)據(jù)亦列于表5中。
3.離心圖象的分析
當(dāng)離心剛開始時如果見到有快速沉降的峰，幾分鐘內(nèi)就到達(dá)分析池底部，一般多是由于樣品發(fā)生部分聚合形成快速沉降的高聚物，如蛋白質(zhì)樣品液遇到某些變性因素時會部分變性而沉淀。離心達(dá)速后樣品的的記心圖象顯示一個對稱的峰形，一般可以認(rèn)為樣品是離心均一的。但是對樣品的真正均一性還應(yīng)用其他方法進(jìn)一步檢測，如電泳，層析等。某些混合樣品偶然亦會給出一個對稱峰的。峰形通常會隨時間而擴(kuò)展，這是由于樣品擴(kuò)散的結(jié)果。但如果峰形擴(kuò)展很快，則該樣品可能是多分散性的。如果離心圖象中表現(xiàn)幾個峰，說明樣品中有幾個組分，每一個峰代表相應(yīng)組分的沉降界面，因此可以測定每一個組分的沉降系數(shù)值。根據(jù)峰的面積可以測量組分的濃度值。
有時離心的圖象表現(xiàn)出一個不對稱的峰，這可能是由于下列幾種情況所致。
①幾個沉降系數(shù)接近的組分峰形重疊，
②樣品是多分散性的，其分子量分布不均勻
③某些相互作用強(qiáng)的高分子，其沉降速度對濃度依賴很大，如DNA，多糖分子，若測定于高濃度，在界面區(qū)由于濃度變化造成沉降速度不一致而致峰形呈不對稱分布。這類樣品在更大濃度時甚至?xí)纬梢环浅＜怃J的界面，在離心沉降圖中表現(xiàn)成一根垂直線，看不到任何峰形。根據(jù)這種圖形測定沉降系數(shù)誤差將很大。通常這類樣品應(yīng)該測定于很稀的濃度，此條件下分子相互作用變小，界面擴(kuò)展的峰形，才可以測到正確的沉降系數(shù)。
4.樣品的純度和濃度測定
分析離心機(jī)可以測定樣品的純度和濃度，這亦是分析離心用途。通常樣品的離心圖形表現(xiàn)一個對稱峰形時，可認(rèn)為該樣品是離心均一的。但是在作純度測定時還要注意樣品的測定濃度，應(yīng)該使樣品測定濃度大于測定方法的靈敏度一百倍以上，測定才有意義。譬如Schlieren光路對該樣品測定靈敏度為 0.1mg/ml，那么該樣品測純度時的濃度應(yīng)該是90mg/ml。假如選用樣1mg/ml濃度測定，沉降圖形即使表現(xiàn)單一峰，仍不能確定其純度是0%還是99%。如果樣品是多組分的，離心圖中表現(xiàn)幾個峰，根據(jù)每個峰的面積與所有峰的總面積的比值可以得到每個組分的相對濃度值。在計(jì)算時應(yīng)該考慮輻射稀釋效應(yīng)，即把各個組分的面積值根據(jù)其所在位置用輻射稀釋公式校正到液面處的值，然后計(jì)算相對。還要注意這樣的濃度估測是建立在各個組分具有相同的折射率比值的假設(shè)基礎(chǔ)上的。根據(jù)峰形面積結(jié)合該組分的濃度與折射率比值和儀器常數(shù)還可以計(jì)算該組掃的絕對濃度值。
5.帶狀沉降法
帶狀沉降法類似于速率區(qū)帶離心法。方法使用合成界面池，在池中預(yù)先加入0.55ml的1M NaCl溶液，然后地2000轉(zhuǎn)／分轉(zhuǎn)速下鋪上0.01ml樣品液，然后加速到30000轉(zhuǎn)／分，用吸收光路記錄樣品沉降圖形。由于NaNl向樣，品帶擴(kuò)散形成一密度梯度區(qū)，可以穩(wěn)定沉降的樣品區(qū)帶。樣品中如果有多個沉降系數(shù)不同的組分，它們將依各自的沉降速度呈區(qū)帶沉降。利用這個方法可以檢定樣品純度，估測組成的相對含量和沉降系數(shù)。適用于微量的核酸和病毒樣品的分析測定。
離心機(jī)是利用離心力對混合液（含有固形物）進(jìn)行分離和沉淀的一種專用儀器。實(shí)驗(yàn)室常用電動離心機(jī)有低速、高速離心機(jī)和低速、高速冷凍離心機(jī)，以及超速分析、制備兩用冷凍離心機(jī)等多種型號。其中以低速（包括大容量）離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)應(yīng)用最為廣泛，是生化實(shí)驗(yàn)室用來分離制備生物大分子必不可少的重要工具。在實(shí)驗(yàn)過程中，欲使沉淀與母液分開，常使用過濾和離心兩種方法。但在下述情況下，使用離心方法效果較好。
① 沉淀有粘性或母液粘稠。
② 沉淀顆粒小，容易透過濾紙。
③ 沉淀量過多而疏松。
?、堋〕恋砹亢苌?，需要定量測定?；蚰敢毫亢苌?，分離時應(yīng)減少損失。
?、荨〕恋砗湍敢罕仨氀杆俜珠_。
?、蕖∫话隳z體溶液。
